新生牛血清的筛选

 实验目的 

   了解新生牛血清在细胞培养中的作用，掌握血清筛选技术。 
  
   实验原理 
    牛血清是细胞培养基中的中药成份之一。在培养基中加入适量血清（10%），首先可以补充细胞生长所需的生长因子、激素、帖附因子等，其次它具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性；再次，它还能中止胰酶的作用，并保护细胞免受机械损伤等。但是血清成分复杂，不同来源、不同批号生产的血清对细胞生长作用的差异较大。血清的保存期只有一年，不同存放时期的血清的效力也不同。所以，当新购得的血清或要在开始一个重大试验的时候，应首先进行牛血清的筛选。 
    筛选时，通常选用正常的二倍体细胞和不太好养的肿瘤细胞，也可以使正要准备培养的细胞。另外，最好用已知优质血清作对照。 
  
   仪器、材料和试剂 
   仪器 
   CO2 培养箱，超净工作台，微量加样器，灭菌锅 
   材料 
   96孔培养板，刻度吸管，移液管，试管，吸管，废液缸，血球计数板，HeLa细胞，Mel细胞 
   试剂 
   DMEM，不同批号的血清，胰酶，双抗 
  
    实验步骤 
    1.取HeLa细胞和Mel细胞（本来应该取正常的二倍体细胞和不太好养的肿瘤细胞，但是实验室条件有限，本组做HeLa细胞），胰酶消化后，用无血清培养基（事先加双抗）吹打成细胞悬液（避免以前血清的干扰）。计数。 
    2.取4000个左右的HeLa细胞加入到每行的第一孔（在加之前要震荡培养基）。本实验经计数后应加11μL细胞。 
    3.在A和H行中第一孔加入89μL含标准血清(2004.12)的培养基。（对照组） 
    4.在A和H行中每一孔中加入100μL含标准血清的培养基。 
    5.将第一孔中的液体吸100μL至第二孔，从第二孔吸100μL至第三孔，然后相同。最后的100μL弃掉。这样就形成了从第一个孔到最后一个孔的细胞梯度从大约2056，1028等至1个。（要吹细均匀） 
    6.每个孔再补加100μL含标准血清的培养基。这可以保证孔中的营养物质。 
    7.在B行采取同样的方法。不同的是用含有需筛选的批号为011217血清代替标准血清。 
    8.在C至G行采用同样的方法。血清批号分别是030224，040528，040830，041012，041016。 
    9.将96孔培养板放入CO2 培养箱37℃培养一周。 
    10. 培养结束后，观察细胞生长的情况。比较在同一细胞浓度下的不同学清对细胞生长的影响。在同一细胞浓度。下细胞生长数最多的培养基所含有的血清即可作为被选择的血清样品。 
  
    实验结果 
    从第五行开始计数，结果见下表

    实验中，我们可以看出C组细胞的集落数是最多的（相对于同一列的来说）。C组细胞是用批号为030224的血清来培养的，这说明030224号血清更能促进HeLa细胞的生长。在别的同学所作的实验中，是E组的Mel细胞生长的最好，这说明040830更能促进Mel细胞的生长。由此看出，不同细胞是适应不同的血清的，不能一概而论。A组和H组是对照组，但并没有长出细胞集落。这个情况在全班中普遍存在，这可能是对照组血清有问题或者做实验时根本没有加血清。

    实验讨论 
    牛血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子（如激素，白细胞介素等），他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值（悬浮培养的细胞除外）；蛋白质（如血清白蛋白，球蛋白等），既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。 
    不同厂家，不同批次生产的血清质量不同，对细胞生长的作用不同，所以在拿到一个新血清或者开始重大科研实验时，要进行新生牛血清的筛选。有些血清可能有支原体污染；不同血清对不同细胞的促进作用不同；血清放置一段时间后，营养价值会降低，所以有必要进行新生牛血清的筛选。新生牛血清最适宜被试细胞生长的血清可以用于长期的实验。 
    本实验中是一次加上所有的细胞的。这样使得每一排的细胞总数的差异减到最小，从而使得系统误差减小；而且，这种方法方便快捷，效率也有所提高；试验结果显示，我们的这种方法却是较为优越。